Chromatographes HPLC

TUNLAB spécialiste en chromatographie HPLC qu’existe sous quatre types différents tels que HPLC en phase inverse, HPLC d’adsorption, HPLC échangeuse d’ions et HPLC d’exclusion depuis bientôt 20 ans.

La chromatographie HPLC qu’est une méthode de séparation des constituants d’un mélange. L’HPLC est une des méthodes analytiques les plus utilisées. Le principe de base de la séparation est le passage d’un liquide (phase mobile) au travers d’une colonne (support solide = phase stationnaire) c’est-à-dire la chromatographie HPLC permet la séparation ou la purification d’un ou de plusieurs composés d’un mélange en vue de leur identification et de leur quantification. L’instrumentation de l’HPLC se compose de plusieurs éléments: une pompe, un injecteur, une colonne et un détecteur. La colonne peut être une colonne en métal ou en Téflon qui est remplie d’une phase (directe ou inverse) et aussi la polarité de la colonne ainsi que le type de solvant ont un impact sur la séparation des molécules dû à l’environnement chimique de l’ensemble.

Application à la chromatographie

A l’origine la chromatographie en phase liquide se faisait sur des colonnes en verre. Le liquide traversait la phase stationnaire par gravité ou sous faible pression. Puis pour augmenter le débit, des manipulations ont été réalisées sous pression plus forte. C’est ce que l’on a appelé la chromatographie liquide sous haute pression (HPLC). Très rapidement le P de pression est devenu le P de performance lorsque l’on a optimisé la technique (diminution de la taille de particules de la phase stationnaire, régularité de cette phase…).

Pour qu’il y ait séparation chromatographique de composés, il faut que leurs molécules interagissent de manières différentes avec au moins une des phases (stationnaire et mobile). Ces phases doivent avoir des polarités différentes.

On peut appliquer la règle “qui se ressemble s’assemble” à l’ensemble soluté – phase stationnaire.

• Si la phase stationnaire est polaire, les composés polaires seront plus retenus que les composés non polaires.
• Si la phase stationnaire est apolaire, les composés apolaires seront plus retenus que les composés polaires.

A l’origine, les colonnes étaient remplies de silice (phase stationnaire polaire). Elle doit sa polarité aux groupements silanols Si-OH qui sont polaires. Pour que la séparation soit efficace, la phase mobile doit alors être peu polaire. L’ensemble “phase stationnaire polaire et phase mobile peu polaire” forme la chromatographie à polarité de phase normale.

Par la suite, les particules de silice (support) ont été enrobées de paraffine en C 18 pour faire une phase apolaire. Dans ce cas, pour que la séparation soit efficace, la phase mobile est polaire (généralement à base d’eau). L’ensemble “phase stationnaire apolaire et phase mobile polaire” forme la chromatographie à polarité de phase inversée.

Aujourd’hui, les phases stationnaires sont greffées chimiquement pour la plupart sur de la silice sphérique et calibrée.

Dans la pratique, chaque séparation nécessite une polarité de la phase mobile qui lui est propre. Chaque solvant ayant une polarité donnée, on ajuste la polarité globale de la phase mobile en mélangeant plusieurs solvants miscibles. A cette composition de phase mobile correspond une force éluant qui caractérise le pouvoir d’entraîner les solutés.

Il faut ajuster la force éluant en fonction des solutés à séparer. Pour cela, on peut utiliser un solvant pur ou un mélange de solvants.

Dans certains cas il est utile de faire varier la force éluant au cours de l’analyse. Si le mélange de différents solvants varie au cours de la séparation, on réalise alors un gradient d’élution, car la meilleure force éluant pour le début de l’analyse n’est pas forcément adaptée pour une bonne séparation des solutés sortant en fin de chromatogramme.

Ces 2 modes sont utilisés pour des analyses en chromatographie à polarité de phase normale ou inversée.

TECHNOLOGIEs

La Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) est un excellent outil pour la séparation, la purification et l’isolement de substances à partir de mélanges complexes (séparation chirale, isolement ou élimination d’impuretés, concentration d’extraits de plantes…).

TUNLAB dispose d’une large gamme de phases stationnaires pour le développement et l’optimisation des processus de purification :

• En phase normale et en phase inverse
• En phase chirale
• En exclusion stérique
• En chromatographie par échange d’ions

La technologie de chromatographie HPLC est parfaitement adaptée à :

• L’isolement des impuretés
• Le dédoublement de racémiques
• La purification d’extraits de plantes
• La préparation de standards analytiques
• Etc…

L’avantage de cette technologie est une extrapolation à l’échelle industrielle simple et rapide : le procédé mis au point à l’échelle laboratoire est transposable directement sur les colonnes industrielles, avec une très bonne reproductibilité. Les produits obtenus en un temps très court sont de très haute pureté, critère indispensable aux requis de l’industrie pharmaceutique.

Critères de choix

Les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant. Ce mélange est introduit dans la phase mobile liquide (éluant). Suivant la nature des molécules, elles interagissent plus ou moins avec la phase stationnaire dans un tube appelé colonne chromatographique.

La phase mobile poussée par une pompe sous haute pression, parcourt le système chromatographique.

Le mélange à analyser est injecté puis transporté au travers du système chromatographique. Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité entre la phase mobile et la phase stationnaire.

En sortie de colonne grâce à un détecteur approprié les différents solutés sont caractérisés par un pic. L’ensemble des pics enregistrés est appelé chromatogramme.

Pour que toute analyse puisse être correctement menée, il est nécessaire de posséder un détecteur. Il en existe notamment deux: le PDA (Photo Diode Array) et la spectrométrie de masse. Le détecteur PDA est celui utilisé au laboratoire. Il permet de mesurer différentes longueurs d’onde dans le spectre du visible et dans le spectre UV.